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Service d’expression et purification de protéine recombinante dans E.Coli
Phase 0 : Synthèse de gène et optimisation de codons
L’étape de synthèse de gène est très importante puisqu’elle nous permet d’optimiser les codons rares pour le système d’expression E. Coli et donc d’augmenter dans certains cas les rendements de production de manière considérable.
Phase I : Clonage de l’ADNc en vecteur d’expression
Cette étape consiste à intégrer l’ADNc dans un vecteur d’expression bactérien contenant un tag qui permettra de purifier la protéine sur colonne.
Phase II : Tests d’expression de la protéine recombinante :
- Transformation dans différentes souches de bactérie
- Culture bactérienne dans différentes conditions
- Induction de synthèse (cinétique sur 5 heures)
- Purification par affinité sur résine spécifique
- Analyse par gel SDS-PAGE (lysats) et/ou Western blot
NB : nous effectuons plusieurs séries de tests afin de déterminer les conditions optimales :
1) de culture pour la production de la protéine
2) d’extraction de la protéine (soluble ou dans les coprs d’inclusion) nécessaire à son folding
3) de purification de la protéine
4) de rendement de la protéine
Nous sommes amenés à faire varier un grand nombre de paramètres pour identifier les conditions optimales d’expression des protéines recombinantes et intervenons à toutes les étapes : optimisation des codons, choix du vecteur, du tag, du milieu de culture, des additifs, des souches bactériennes, des températures d’induction, des concentrations en IPTG, du type de purification, de la technique de refolding (Dialyse, changement de tampon)….. Notre flexibilité sur la mise au point des meilleures conditions fait notre force.
Phase III : Production & Purification de la protéine recombinante :
- Culture bactérienne : 1 ou plusieurs litres
- Induction de synthèse selon protocole établi pendant la phase II
- Préparation des lysats bactériens
- Purification par affinité sur résine spécifique
- En option : élimination du tag par clivage enzymatique
NB : la Phase de production est réalisée selon les desiderata du client en fonction des résultats obtenus en fin de Phase Test. Suite au scale-up (passage d’une culture de 0,5 à 1 litre ou plus).
Délais moyens :
- Clonage : 2 semaines
- Tests d’expression : 10 jours
- Production & Purification : 5 jours